Фибробласты в лечении ожогов
Важнейшее значение в комплексной интенсивной терапии тяжелообожженных имеет местное лечение ожоговых ран. Токсичность продуктов распада тканей, инфицирование ожоговых ран, водно-электролитные, белковые, энергетические потери через раневую поверхность обусловливают ведущую роль ожоговой раны в патогенезе ожоговой болезни и ее осложнений. В этих условиях главной хирургической задачей в лечении больных с глубокими обширными ожогами становится современная хирургическая обработка раны и ее адекватное пластическое закрытие.
Восстановление целостности кожного покрова у пациентов с обширными и глубокими ожогами, даже при благоприятном течении ожоговой болезни, занимает не менее 1-2 месяцев. При этом применение активной хирургической тактики, направленной на удаление ожогового струпа с последующей аутодермопластикой ран, бывает значительно затрудено из-за дефицита неповрежденной кожи, которую можно использовать для трансплантации. Новые подходы к решению проблемы дефецита «донорских» ресурсов при обширных термических поражениях наметились с развитием биотехнологии, когда появилась возможность получать жизнеспособные клетки кожи и даже пласты таких клеток в лабораторных условиях. Но при использовании имплантатов из культивируемых кератиноцитов выявился ряд недостатков этого метода. Поэтому наряду с работами по совершенствованию существующего метода ведутся поиски новых технологий использования культивируемых тканей для восстановления кожных покровов у обожженных. В настоящее время проводятся исследования по разработке новых методов местного лечения ожогов с помощью не кератиноцитов, а культивируемых аллофибробластов человека. Использование фибробластов имеет ряд преимуществ:
· получение фибробластов в культуре не требует дорогостоящих питательных средств, стимуляторов роста, а, следовательно, больших материальных затрат;
· фибробласты в культуре легко подвергаются пассированию;
· при пассировании фибробласты частично утрачивают поверхностные антигены гистосовместимости, что открывает возможность использовать для изготовления трансплантатов аллоклеток и создания банков клеток;
· сокращаются сроки получения трансплантатов, готовых к использованию в клинике, до 2-3-х дней.
Трансплантация культивированных фибробластов проводилась при лечении:
а) обширных «пограничных» ожогов III степени;
б) обширных глубоких ожогах IIIБ-IV степени;
в) длительно не заживающих донорских участках после аутодермопластики.
Трансплантации культивированных фибробластов на ожоговые раны предшествовало комплексное лечение, направленное на подготовку больного и ран к оперативному лечению. Больным проводиться общепринятое лечение, включающее: противошоковую терапию, лечение острой ожоговой токсемии, септикотоксемии. Местное лечение предусматривает формирование ожогового струпа с последующей некрэктомией. Для формирования ожогового струпа используется 1% раствор йодопирона. После выполнения некрэктомии дальнейшая подготовка ран к трансплантации культивированных фибробластов проводится с помощью современных мазей на полиэтиленгликолевой основе — левосина, левомеколя, 5% диоксидиновой мази, а также перфорированной ксенокожи. При обширных циркулярных ожогах туловища и конечностей лечение больных осуществляется с использованием флюоридирующей кровати «Клинитрон». Это позволяет быстрее мумифицировать ожоговый струп, уменьшить ожоговую интоксикацию, создать абактериальные условия для лечения ран как в до-, так и в послеоперационном периоде. В результате формируются гранулирующие раны, бактериальная обсемененность которых не превышала 10 микробных тел на 1 г. Непосредственно перед трансплантацией фибробластов раневую поверхность промывали 3% раствором перекиси водорода. Каждый трансплантат фиксируется на раневой поверхности с помощью парафинизированной марли. Синтетические носители удаляли через 2-3 дня после трансплантации. В дальнейшем лечение пограничных ожогов III степени проводится с использованием мазей на полиэтиленгликолевой основе до полной эпителизации ран.
При глубоких ожогах IIIБ-IV степени выполняется комбинированная аутодермопластика с трансплантацией культуры фибробластов: после трансплантации фибробластов и удаления синтетической подложки производится пластическое закрытие ран сетчатым кожным лоскутом, перфорированным 1 : 6. Благодаря способности фибробластов активно стимулировать адгезию, пролиферацию кератиноцитов, аутотрансплантат, несмотря на высокую степень перфорации, приживается быстро и эффективно.
Трансплантации фибробластов на незаживающие раны донорских участков предшествует антибактериальная терапия. После трансплантации наблюдается быстрая эпителизация ран.
Трансплантация фибробластов обусловливает быструю смену фаз воспаления. Уже через 3-4 суток после трансплантации среди клеток в мазках отпечатков с поверхности ран преобладают фибробласты, количество которых к 7-м суткам достигало 42%. Число же полинуклеарных лейкоцитов быстро уменьшается. Одновременно с этим и в клеточном составе грануляционной ткани отмечается преобладание фибробластов над всеми другими типами клеток. Эпидермис, формирующийся после трансплантации культур фибробластов, характеризуется неравномерной толщиной, четкой дифференцировкой всех слоев, 1-2-рядным расположением клеток базального слоя.
Таким образом, на основе современных морфологических и биотехнологических методов удается реализовать новые подходы к решению проблемы местного лечения термических поражений путем трансплантации in vivo клеток, полученных в условиях культуры. Разработан оригинальный метод местного лечения ожогов с использованием культур аллофибробластов человека. По сравнению со всеми известными данный метод обладает рядом преимуществ. При пограничных ожогах III степени и длительно незаживающих ранах донорских участков трансплантация фибробластов стимулирует пролиферацию эпидермиса в его очажках, сохранившихся после повреждения. При глубоких ожогах IIIБ-IV степени — пролиферацию эпидермоцитов аутолоскута. Это обусловливает быструю эпителизацию ожоговых ран и эффективное восстановление кожных покровов даже при критических ожогах; значительно уменьшает вероятность развития опасных для жизни осложнений ожоговой болезни, сокращает сроки пребывания больных в стационаре, улучшает функциональные и косметические результаты лечения.
Методическая простота, исключение их технологического цикла дорогостоящих питательных средств и биостимуляторов роста, сокращение сроков получения трансплантата из аллофибробластов до 3 дней обеспечивают возможности внедрения метода в широкую клиническую практику.
Источник
Заживление ран — динамический процесс, который включает в себя механизмы свертывания крови, воспаления, клеточной пролиферации, формирования новых кровеносных сосудов, реконструкции экстрацеллюлярного матрикса [73] и контролируется множеством клеточных факторов [1]. Биологически заживление ран протекает через три общие стадии: воспалительную, пролиферативную и репаративную, или ремоделирование [2]. Раневой процесс является комплексным и определяется взаимодействием факторов роста и клеточных ассоциаций фибробластов, эпителиальных и эндотелиальных клеток, играющих ключевую роль [7]. В настоящее время можно считать установленным, что заживление ран ускоряется различными факторами роста, влияющими на пролиферацию и дифференцировку клеток [4, 56].
Известно, что факторы роста фибробластов — семейство полипептидов, участвующих в процессах ангиогенеза, заживления ран и в эмбриональном развитии. У млекопитающих и человека до недавнего времени было установлено 22 пептида, относящихся к семейству факторов роста фибробластов, с молекулярной массой, колеблющейся от 17 до 34 кДа [48]. Недавно был идентифицирован новый член семейства факторов роста фибробластов — фактор роста фибробластов — 23. Он активно регулирует количество фосфатов крови через механизмы обратной связи, вовлекающие гормоны паращитовидных желез и витамин D [53]. Факторы роста фибробластов у человека продуцируются кератиноцитами, фибробластами, хондроцитами, эндотелиальными, гладкомышечными и тучными клетками [15].
В период эмбрионального развития они играют важную роль в регуляции клеточной пролиферации, миграции и клеточной дифференцировке. В зависимости от типа клетки, стадии ее развития, вида фактора роста фибробластов она может ответить пролиферацией, миграцией, апоптозом или стимуляцией/ингибицией дифференцировки [20].
Во взрослом организме факторы роста фибробластов. поддерживая гомеостаз, участвуют в восстановлении тканей (физиологическая регенерация) или синтезируются в ответ на повреждение (репаративная регенерация). Они стимулируют рост множества типов клеток, включая фибробласты, эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки сосудов и миобласты [14]. Некоторые факторы роста фибробластов являются необходимыми при передаче нервного импульса в центральной и периферической нервной системе [48]. Факторы роста фибробластов обладают цитопротективным свойством, приводя к быстрому ограничению цитолиза [9].
Факторы роста фибробластов опосредуют свои биологические эффекты через связывание с четырьмя специфическими, высокоаффинными рецепторами, расположенными на клеточной мембране. Они принадлежат к семейству тирозин-киназных рецепторов [51], состоят из двух или трех внеклеточных иммуноглобулиноподобных доменов (внеклеточная кислая область) и цитоплазматической тирозинкиназной части [47]. Для активации этих рецепторов необходимо взаимодействие факторов роста фибробластов с такими протеогликанами, как гепарин и гепарансульфат [27, 60, 70].
Наиболее важными в процессе заживления ран кожи являются фактор роста фибробластов-2, фактор роста фибробластов-7 и фактор роста фибробластов-10 [13]. Фактор роста фибробластов-2, или основной фактор роста фибробластов — это полипептид, состоящий из 146 аминокислот, имеющий молекулярную массу 16,5-18,2 кДа и оказывающий митогенное действие на клетки тканей нейроэктодермального и мезодермального происхождения [18]. Он является одним из наиболее важных проангиогенных медиаторов, участвующих в заживлении ран [59].
Основной фактор роста фибробластов стимулирует деление фибробластов, сосудистых эндотелиальных клеток и кератиноцитов in vitro, формирование новых сосудов, грануляционной ткани, эпидермальную регенерацию in vivo и регулирует гомеостатические процессы в нервной системе [36, 38]. При искусственном уменьшении концентрации основного фактора роста фибробластов у экспериментальных животных нарушается процесс трансформации фибробластов в фиброциты, а также меняется соотношение клеток фибробластического ряда [8].
Основной фактор роста фибробластов обнаружен в разнообразных клетках и из всех известных факторов роста имеет наиболее широкий диапазон клеток-мишеней. Он способен значительно повышать пролиферацию клеток в концентрации 1 нг/мл [18].
Фактор роста фибробластов-2 стимулирует секрецию эндотелиальными клетками протеазы и активаторов плазминогена, которые деградируют базальную мембрану сосудов, усиливая миграцию клеток в окружающий матрикс, способствуя тем самым формированию новых сосудов [19]. Также он активирует синтез матриксных макромолекул, особенно дермальных гликозаминогликанов, гиалуроновой кислоты [33] и ингибирует синтез коллагеназы-1 в кератиноцитах [50].
Этот цитокин обнаруживается в экстрацеллюлярном матриксе и на базальной мембране, будучи связанным с гепарансульфат протеогликаном, и действует локально при возникновении повреждения [45]. N. Nissen и соавт. [42] показали, что его уровень быстро возрастает в зоне операционной раны. Фактор роста фибробластов-2 играет важную роль в формировании грануляционной ткани, реэпителизации и ремоделировании тканей [51].
H. Song и соавт. [55] показали, что основной фактор роста фибробластов синтезируется в нормальной коже вокруг сосудов. При повреждении кожных покровов синтез его резко увеличивается эндотелиоцитами и фибробластами.
Экспрессия основного фактора роста фибробластов значительно увеличивается в ожоговой ране. Его синтез повышается через 6 ч после ожога и достигает максимума через сутки после травмы. Его гены чаще всего обнаруживаются в цитоплазме фибробластов [26]. H. Wang и соавт. [63] установили, что эпителиальные клетки начинают усиленно синтезировать основной фактор роста фибробластов через 30 мин после ранения, а максимальная его концентрация обнаруживается уже через 24-96 ч.
G. McGee и соавт. [39] предположили, что основной фактор роста фибробластов может способствовать более быстрому заживлению ран. Они изучили его действие на крысах. На 3-и сутки после получения раны крысам наносили фактор роста фибробластов-2 в дозе 400 нг. При гистологическом исследовании тканей из раневых дефектов на 5, 6 и 7-е сутки обнаружили более быстрое заживление и лучшую их организацию.
B. Cheng и соавт. [17] показали, что основной экзогенный фактор роста фибробластов влияет на процесс заживления раны, воздействуя на механизмы миграции сосудистых эндотелиальных клеток. В группе животных, получавших фактор роста фибробластов-2, уровень пролиферации сосудистого эндотелия был явно выше на 7-е и 14-е сутки по сравнению с контролем. Его применение для лечения поверхностных ожогов площадью 30% у крыс также способствовало повышению уровня эпителизации по сравнению с контролем. M. Komori и соавт. [32] в экспериментальной работе на животных выявили значительное усиление ангиогенеза на ранних этапах заживления ран при локальном нанесении на них фактора роста.
T. Yukami и соавт. [69] показали, что применение основного фактора роста фибробластов уже на 7-е сутки нормализует раневой процесс, усиливает миграцию кератиноцитов, ангиогенез, формирование грануляционной ткани и экспрессию других факторов роста. H. Mutsuzaki и соавт. [40] считают, что применение фактора роста фибробластов-2 снижает уровень воспаления в ранах.
Применение основного фактора роста фибробластов повышает уровень выживаемости кожных трансплантатов из-за повышения их реваскуляризации. Так, T. Sun и соавт. [57] установили, что при его применении кожные лоскуты у крыс некротизировались в 18,2% случаев, что было ниже по сравнению с контролем, который составил 37,14%. P. Liu и соавт. [35] показали, что комбинация фактора роста фибробластов-2 и сосудистого эндотелиального фактора роста значительно повышала выживаемость кожных лоскутов у крыс. Однако B. Bandera и соавт. [12] получили данные, говорящие о том, что основной фактор роста фибробластов значительно лучше предохраняет кожные трансплантаты от некроза, чем сосудистый эндотелиальный фактор роста.
Применение основного фактора роста фибробластов оказалось полезным при лечении бактериально загрязненных ран [28]. Рекомбинантный человеческий основной фактор роста фибробластов наносился на ожоговые раны, загрязненные Escherichia coli, на 5, 9, 12, 15 и 18-й день после травмы. Раны, для лечения которых использовался фактор роста фибробластов-2, заживали быстрее, чем у контрольных животных, и количество бактерий у подопытных крыс не росло по сравнению с контролем.
A. Dantas Filho и соавт. [21] обнаружили ускорение заживления мультибактериально загрязненных ран при применении основного фактора роста фибробластов, который к тому же стимулировал созревание коллагена.
Использование ростового фактора оказалось полезным для стимуляции заживления ран при диабете, лучевой болезни и алиментарной дистрофии. Так, R. Tsuboi и D. Rifkin [62] испытали основной фактор роста фибробластов на мышах со сниженными возможностями заживления ран. Получено существенно более быстрое заживление ран. При применении основного фактора роста фибробластов формирование грануляционной ткани было максимальным в период с 8-го по 12-й день. Результаты применения фактора роста фибробластов-2 в лечении ожогов у крыс, страдающих лучевой болезнью [72], показали, что заживление ран было лучше на 28% и они эпителизировались существенно быстрее, чем в группе контрольных животных. K. Zhang и соавт. [71] считают, что применение фактора роста фибробластов улучшает заживление лучевых ожогов кожи, причем происходит повышение пролиферации кератиноцитов и улучшение их барьерной функции.
Y.-W. Niu и соавт. [43] исследовали действие основного фактора роста фибробластов на ожоги II степени у крыс, страдающих диабетом. На 14-й день после получения ожогов в группе, в которой использовался препарат, уровень заживления был выше, чем у крыс, страдающих диабетом (53,14±11,44% против 25,40±3,00% соответственно).
Применение факторов роста фибробластов для стимуляции заживления ран показало благоприятные результаты и в клинической практике. Так, Х. Fu и соавт. [25] исследовали влияние основного рекомбинантного свиного фактора роста фибробластов на заживление ран различной этиологии. Клинические исследования проведены у 839 пациентов с ожогами, донорскими ранами. 641 пациент с подобными ранами составил контрольную группу. С ожогами II и III степени было 654 пациента: 330 получали рекомбинантный свиной основной фактор роста фибробластов и 324 — плацебо. В группе донорских ран 509 пациентов получали исследуемый препарат и 317 составили группу контроля. Все поверхностные, глубокие ожоги и донорские раны при использовании препарата имели более высокий темп формирования грануляционной ткани и эпидермальной регенерации по сравнению с группами контроля.
Z. Wu и соавт. [64] в ретроспективном анализе лечения 72 больных с глубокими термическими ожогами отметили, что ранние аппликации основного фактора роста фибробластов во многих наблюдениях предотвращают возникновение сепсиса, а также ускоряют заживление ожоговых ран. Y. Yao и соавт. [68] отметили сокращение времени заживления хирургических ран при применении различных доз фактора роста фибробластов-2.
M. Noguchi и соавт. [44] описали 3 наблюдения ишемических язв, леченных спреем основного фактора роста фибробластов. У всех больных он способствовал ускорению заживления ран и полной их эпителизации. Для излечения больных с устойчивыми к терапии ранами, имеющими обширные полости, A. Nakanishi и соавт. [41] применили рекомбинантный человеческий основной фактор роста фибробластов совместно с коллагеновой губкой и получили их быстрое заживление.
C. Yao и соавт. [67] применили ростовой фактор для лечения хронических язв. Они лечили 58 больных, в том числе 30 получали основной фактор роста фибробластов, 28 человек были группой плацебо. В 90% наблюдений в опытной группе язвы зажили через 3 нед после начала лечения, в группе плацебо отмечено заживление только 53,6% язв. Никаких побочных эффектов при применении данного препарата не возникло. K. O’Goshi и H. Tagami [46] описали 9 наблюдений различных хронических кожных язв, стойких к терапии, которые успешно были излечены с помощью распыления на рану фактора роста фибробластов-2. При этом наблюдалось ускорение процессов заживления ран с последующей их эпителизацией.
В ожоговом отделении Beijing Jishuitan Hospital в Китае с марта 2000 г. по июнь 2006 г. находились на лечении 18 пациентов с хроническими кожными язвами. Продолжительность их болезни составляла от полугода до 4 лет. При обычной терапии язвы не заживали. При использовании основного фактора роста фибробластов полное заживление ран в течение 6 нед отмечено в 83,3% наблюдений и средняя длительность заживления оказалась равной 34,4 дня. В течение 1-3 лет у 14 пациентов рецидивов язв не было. С 4 пациентами исследователи потеряли контакт [16].
S. Akita и соавт. [10] продемонстрировали возможность избежать образования гипертрофических рубцов после ожоговых ран при одновременном применении хирургической обработки и основного фактора роста фибробластов с последующим пластическим закрытием ран. Отмечено значительное уменьшение толщины и жесткости послеожогового рубца по сравнению с контролем.
H. Eto и соавт. [23] считают, что фактор роста фибробластов-2 можно использовать для лечения гипертрофических и келоидных рубцов.
Другими важными членами семейства ростовых факторов являются фактор роста фибробластов-7, или фактор роста кератиноцитов-1, и его гомолог фактор роста фибробластов-10, или фактор роста кератиноцитов-2, которые выделяются в «острых» ранах [29]. Фактор роста фибробластов-7 был первоначально идентифицирован как специфичный паракринный фактор роста для эпителиальных клеток [24]. Последующие исследования выявили, что фактор роста кератиноцитов-1 выделяется во время получения травмы кожи у животных и у людей и ускоряет их заживление [49]. Экспрессия фактора роста кератиноцитов-2 также увеличивается при повреждениях кожных покровов.
Факторы роста фибробластов-7 и -10 взаимодействуют с рецепторами факторов роста фибробластов-2-IIIb, которые находят только в кератиноцитах. Взаимодействие с рецепторами происходит с помощью гепарина, но его высокие концентрации ингибируют активность данных цитокинов [31, 61]. Исследования in vitro показали, что факторы роста фибробластов-7 и -10 стимулируют пролиферацию и миграцию кератиноцитов и играют важную роль в реэпителизации [37, 52]. Y. Yang и соавт. [66] показали, что фактор роста кератиноцитов-2 более эффективно стимулирует пролиферацию кератиноцитов по сравнению с эпителиальным фактором роста.
S. Tagashira и соавт. [58] установили, что синтез фактора роста фибробластов-10 повышается через сутки после получения раны и снижается через 3 сут. Авторы предположили, что он является первичным фактором, участвующим в заживлении ран. Считается, что факторы роста кератиноцитов значительно усиливают эпителизацию ран [11, 22, 34].
Y. Xia и соавт. [65] в экспериментальной работе определили, что фактор роста кератиноцитов-1 и -2 значительно усилил реэпителизацию ран ишемизированных тканей у кроликов. Кроме того, фактор роста кератиноцитов-2 способствовал образованию грануляционной ткани, хотя данный эффект отсутствовал при применении фактора роста кератиноцитов-1. Имелась выраженная пролиферация дермальных клеток при применении фактора роста фибробластов-10 на 7-й день по сравнению с таковой без его применения. Авторы считают, что фактор роста кератиноцитов-2 по сравнению с фактором роста кератиноцитов-1 наиболее эффективен и способствует формированию менее выраженных рубцов. P. Jimenez и M. Rampy [30] подтвердили ускорение заживления ран кожи при применении фактора роста кератиноцитов-2, определив его как мощный стимулятор заживления ран, увеличивающий механическую прочность рубца вследствие повышения содержания коллагена.
C. Sobral и соавт. [54] показали, что генетически модифицированные кератиноциты с усиленным синтезом фактора роста кератиноцитов, а также добавление его к культивированным кератиноцитам снижают жизнеспособность бактерий Pseudomonas aeruginosa.
Результаты многочисленных экспериментальных работ и приведенные клинические наблюдения позволяют утверждать, что факторы роста фибробластов способствуют заживлению ран и ожогов, что может значительно облегчить лечение травматической и ожоговой болезни и улучшить исходы лечения ранений и термической травмы. В настоящее время факторы роста фибробластов для клинического применения получают путем встраивания гена, кодирующего их синтез, в генотип бактерий. Для этой цели используют, в частности, Escherichia coli [3]. Однако широкое клиническое использование уже известных лекарственных средств, содержащих факторы роста фибробластов, сдерживается сложностью и высокой стоимостью технологии получения фармацевтической субстанции и небольшими, фактически лишь лабораторными объемами ее производства. Очевидно, что поиск новых, более доступных источников факторов роста фибробластов чрезвычайно актуален.
В результате исследований В.И. Никитенко [6] в культуральной жидкости бактерий Bacillus subtilis 804 обнаружен и получен ранее неизвестный фактор роста фибробластов, обладающий способностью усиливать рост фибробластов in vitro. Этот фактор является комплексом 4 белков с молекулярной массой от 11 до 14 кДа. В отличие от известных факторов он термостабилен, его инактивация наступает при 128 °С. При применении нового фактора роста фибробластов в дозе 1 нг/мл во время экспериментальной аутодермопластики отмечены уменьшение капиллярного кровотечения в период первой сосудисто-эндотелиальной фазы, побледнение грануляций, быстрая, в течение 1-5 мин, фиксация кожных трансплантатов и полное их приживление [5]. Технология получения оригинального ростового фактора довольно проста, легко воспроизводима и не требует больших материальных затрат.
Данные литературы свидетельствуют, что факторы роста фибробластов позволят создать группу оригинальных лекарственных препаратов, стимулирующих регенераторные процессы. Очень перспективно направление по разработке принципиально новых гемостатиков на их основе.
Источник