Пересадка клеток при ожоге

in corneal burns in experiment
L.R. Nikolaeva, E.V. Chentsova,
M.V. Marei, G.L. Suhih
MNII of Gelmgoltsa of Roszdrav
Institute of Biology Development of Koltsov N.K.
Scientific Center of Obstetrics, Ginecology and Perinatology of RAMN, Moscow
Purpose: to study the influence of stem cells transplantation on the corneal reparation in experiment.
Materials and methods: Study was performed on the 75 chinchilla rabbits. Severe burn was created by application on the cornea of cotton fabric disc 7 mm diameter, sodden with 10% NaOH solution during 40 seconds. Cultured stem cells, which were taken from tissue of anterior cerebrum of embryo of 1 term of gestational process, were injected subconjunctivally in the studied animal’s eyes immediately after burn. Physiological solution was injected into the control eyes. Clinical evaluation of the condition of animal’s eyes was performed on 7, 14, 22, 30 and 60 days with focal and side illumination and biomicroscopy with fluorescein probe and photoregistration.
Results: Clinical study of studied animals eyes showed the acceleration of reparative processes in epithelium and corneal stroma, decrease of opacity density and square in comparison with control eyes. Corneal vascularization was more intense in control eyes. Productive inflammatory stage in experimental eyes with usage of cell technologies was notably reduced.
Conclusions: Stem cells exert stimulating influence on corneal reparation in burns in experiment.

Ожоги глаз являются тяжелыми повреждениями органа зрения и до настоящего времени представляют серьезную медицинскую и социальную проблему. По данным литературы, частота ожогов глаз составляет до 38,4% всех глазных травм [2] и отличается большим количеством неблагоприятных исходов – более 40% пострадавших становятся в дальнейшем инвалидами 1–2 групп по зрению [3].
Совокупность взаимодействия физиологических и биохимических преобразований при ожогах глаз приводит к нарушению репаративно–регенераторных процессов в роговице, что, в свою очередь, является причиной возникновения рецидивирующих эрозий, длительно незаживающих язв роговицы, а впоследствии – грубых, интенсивно васкуляризованных бельм [5].
Предложено большое количество терапевтических и хирургических методов лечения ожогов роговицы. Несмотря на это, по–прежнему высоким остается процент неблагоприятных исходов и осложнений, требующих проведения сложных оптико–реконструктивных операций. Анализ данных литературы свидетельствует, что успех кератопластики достигается далеко не всегда, а помутнение, некроз и отторжение трансплантата являются частыми спутниками ожоговой болезни. При кератопластике по поводу аваскулярных бельм частота отторжения трансплантата достигает 35%, а при васкуляризованных – до 50–65% [4,6].
Вот почему сохраняет свою актуальность проблема поиска новых эффективных методов, применение которых позволит уменьшить количество осложнений и добиться удовлетворительных функциональных результатов.
Учитывая все вышеизложенное, целью нашей работы стало изучение влияния трансплантации стволовых клеток (СК) на репарацию роговицы при экспериментальном ожоге.
Материалы и методы. Источником донорского материала служила ткань мозга эмбрионов 1–го триместра гестации (8–12 недель). Культуры исследовали на стерильность, острую токсичность и пирогенность. Перед трансплантацией суспензию клеток тщательно отмывали от культуральной среды, подсчитывали количество жизнеспособных клеток и суспензировали в минимальном количестве физиологического раствора.
Исследование проводилось на 75 кроликах (150 глаз) весом 2–2,5 кг, на которых была создана модель тяжелого щелочного ожога роговицы (аппликация роговицы диском хлопчатобумажной ткани диаметром 7 мм, пропитанным 10% раствором NаОН, время экспозиции 40 с). Животные были разделены на 2 группы – опытную и контрольную. В опытной группе сразу после нанесения ожога производилась субконъюнктивальная инъекция суспензии стволовых клеток с отработанной ранее концентрацией 300 тыс. клеток в 0,2 мл физиологического раствора. В контрольной группе вводили 0,2 мл физиологического раствора. С целью профилактики развития вторичной инфекции на всех глазах проводили местную противоинфекционную терапию в виде инстилляций антибиотиков (0,25% раствор левомицетина 3 раза в день).
Клинические методы исследования включали осмотр переднего отрезка глаз с помощью фокального и бокового освещения и биомикроскопию с флюоресцеиновой пробой и фоторегистрацией.
Оценку состояния глаз проводили на 7, 14, 22, 30 и 60–е сутки после трансплантации по следующим признакам: степени выраженности воспалительной реакции, диаметру дефекта эпителия, площади и глубине стромального дефекта роговицы, степени неоваскуляризации роговицы, интенсивности помутнения роговицы.
Степень выраженности воспалительной реакции оценивали по балльной системе Ченцовой Е.В. [4]. Площадь дефекта стромы роговицы определяли с помощью биомикроскопии. Дефект стромы по глубине изучали по схеме Венворта. Для оценки степени неоваскуляризации роговицы измеряли длину сосудов от лимба к центру роговицы [4]. Интенсивность помутнения роговицы оценивали по шкале Войно–Ясенецкого [1].
Результаты. На 7-е сутки после трансплантации в опытной группе глаз отмечалась менее выраженная, по сравнению с контролем, воспалительная реакция, а также не наблюдались перфорации, в то время как на 13,3% контрольных глаз имела место перфорация в 4 балла (рис. 1). В опыте проявлялась тенденция к уменьшению площади и глубины эрозии и изъязвления роговицы (рис. 2). На 82,7% опытных глаз диаметр эпителиального дефекта был в пределах 5 мм в среднем, т.е. на 2 мм меньше диаметра очага поражения. Диаметр эпителиального дефекта в контрольной группе был равен исходной величине – 7мм.
На 14-е сутки наблюдения воспалительная реакция в опытной группе глаз на 32% была меньше выражена, чем в контроле. В контрольной группе глубокие дефекты роговицы наблюдались в 86,7% случаев (рис. 3). Случаи перфорации роговицы участились на 5,5%, в то время как на большинстве опытных глаз (69,3%) имели место поверхностные дефекты стромы, площадь которых не превышала 1 балла. На 69,3% опытных глаз наблюдалась васкуляризация роговицы в 2 балла. Васкуляризация роговицы в 3 балла в опытной группе глаз встречалась в 3,2 раза реже, чем в контрольной группе (рис. 4). Отмечалось значительное уменьшение диаметра эпителиального дефекта в опыте (3 мм в среднем – 1 балл), в то время как в контроле он был близок к исходной величине (6 мм в среднем – 3 балла).
На 22-е сутки после трансплантации в опытной группе глаз в большинстве случаев наблюдалось закрытие стромального дефекта роговицы (58,7%), в то время как в контроле в 56% случаев сохранялись глубокие дефекты роговицы в 2 и 3 балла (рис. 5). Васкуляризация в 3 балла имела место в опыте в 4 раза реже по сравнению с контролем (рис. 6). Интенсивность помутнения по шкале Войно–Ясенецкого в опытной группе соответствовала 7 баллам, в контрольной – 10 баллам.
К 30-му дню после трансплантации в 89,3% случаев в опыте наблюдалось закрытие эпителиального дефекта, в то время как в контрольной группе глаз в 30,7% сохранялись поверхностные дефекты стромы (1 балл) (рис. 7). Степень васкуляризации и воспалительной реакции были также больше выражены в контроле (3 и 1 балла соответственно в контроле и 1 балл и 0 баллов в опытной группе глаз) (рис. 8). Интенсивность помутнения в опытной группе в среднем соответствовала 7 баллам прозрачности по шкале Войно–Ясенецкого, в то время как в контроле в большинстве случаев наблюдались помутнения в 10 баллов.
Спустя 60 суток после трансплантации в контрольной группе глаз в 12% случаев сохранялся поверхностный дефект стромы и в 17,3% – персистирующая эрозия (рис. 9), в то время как в опытной группе наблюдалось полное закрытие эпителиального дефекта роговицы на всех глазах (рис. 10). В опытной группе отмечалось формирование более нежного бельма роговицы по сравнению с контрольной (7 и 10 баллов соответственно). Степень васкуляризации и воспалительной реакции были более выражены в контроле (3 и 1 балла соответственно в контроле и 1 балл и 0 баллов в опыте).
Анализируя приведенные данные, можно сделать следующие выводы:
1. Разработана методика трансплантации СК при ожогах роговицы в эксперименте.
2. Эффект трансплантации СК проявляется в ускорении процессов восстановления дефектов переднего эпителия и стромы роговицы (рис. 11).
3. Трансплантация СК на ожоговую поверхность роговицы способствует формированию помутнения роговицы меньшей интенсивности и площади.
4. Трансплантация СК при экспериментальных ожогах роговицы снижает степень васкуляризации роговицы.
5. Трансплантация СК при ожогах роговицы способствует сокращению продуктивной стадии воспаления тканей глаза.
6. На основании полученных клинических данных доказана эффективность трансплантации СК в ранние сроки после ожога.
Таким образом, результаты проведенного экспериментального исследования свидетельствуют о положительном влиянии трансплантации стволовых клеток на течение ожоговой болезни и подтверждают целесообразность дальнейшего изучения данного вопроса в офтальмологии.

Литература
1. Войно–Ясенецкий В.В. Разрастание и изменчивость тканей глаза при его заболеваниях и травмах. – Киев, 1979. – 184с.
2. Гундорова Р.А., Бордюгова Г.Г., Южаков А.М. Лечение и профилактика осложнений ожогов органа зрения: Метод. рекоменд. – М., 1982. – 11с.
3. Либман Е.С., Кремкова Е.В., Иофан К.Л. Эпидемиология ожогов глаз и инвалидности вследствие ожоговой болезни // Новое в лечении ожогов глаз: Тез. докл. симпоз. с участием иностранных специалистов. – М., 1989. – С.76–77.
4. Ченцова Е.В. Система патогенетически обоснованного лечения ожоговой травмы глаз. Дис. Е д–ра мед. наук. М. – 1996. – 304 с.
5. Pfister R.K. Chemical corneal burns //Int. Ophthalmol. Clin. – 1984. – V.24, № 2. – P.157–168.
6. Stark W. Transplantation antigens and keratoplasty //Microsurgery of anterior and posterior segments of the eye. – 1981.– P.33–40.

L.R. Nikolaeva, E.V. Chentsova,
M.V. Marei, G.L. Suhih
MNII of Gelmgoltsa of Roszdrav
Institute of Biology Development of Koltsov N.K.
Scientific Center of Obstetrics, Ginecology and Perinatology of RAMN, Moscow
Purpose: to study the influence of stem cells transplantation on the corneal reparation in experiment.
Materials and methods: Study was performed on the 75 chinchilla rabbits. Severe burn was created by application on the cornea of cotton fabric disc 7 mm diameter, sodden with 10% NaOH solution during 40 seconds. Cultured stem cells, which were taken from tissue of anterior cerebrum of embryo of 1 term of gestational process, were injected subconjunctivally in the studied animal’s eyes immediately after burn. Physiological solution was injected into the control eyes. Clinical evaluation of the condition of animal’s eyes was performed on 7, 14, 22, 30 and 60 days with focal and side illumination and biomicroscopy with fluorescein probe and photoregistration.
Results: Clinical study of studied animals eyes showed the acceleration of reparative processes in epithelium and corneal stroma, decrease of opacity density and square in comparison with control eyes. Corneal vascularization was more intense in control eyes. Productive inflammatory stage in experimental eyes with usage of cell technologies was notably reduced.
Conclusions: Stem cells exert stimulating influence on corneal reparation in burns in experiment.

Ожоги глаз являются тяжелыми повреждениями органа зрения и до настоящего времени представляют серьезную медицинскую и социальную проблему. По данным литературы, частота ожогов глаз составляет до 38,4% всех глазных травм [2] и отличается большим количеством неблагоприятных исходов – более 40% пострадавших становятся в дальнейшем инвалидами 1–2 групп по зрению [3].
Совокупность взаимодействия физиологических и биохимических преобразований при ожогах глаз приводит к нарушению репаративно–регенераторных процессов в роговице, что, в свою очередь, является причиной возникновения рецидивирующих эрозий, длительно незаживающих язв роговицы, а впоследствии – грубых, интенсивно васкуляризованных бельм [5].
Предложено большое количество терапевтических и хирургических методов лечения ожогов роговицы. Несмотря на это, по–прежнему высоким остается процент неблагоприятных исходов и осложнений, требующих проведения сложных оптико–реконструктивных операций. Анализ данных литературы свидетельствует, что успех кератопластики достигается далеко не всегда, а помутнение, некроз и отторжение трансплантата являются частыми спутниками ожоговой болезни. При кератопластике по поводу аваскулярных бельм частота отторжения трансплантата достигает 35%, а при васкуляризованных – до 50–65% [4,6].
Вот почему сохраняет свою актуальность проблема поиска новых эффективных методов, применение которых позволит уменьшить количество осложнений и добиться удовлетворительных функциональных результатов.
Учитывая все вышеизложенное, целью нашей работы стало изучение влияния трансплантации стволовых клеток (СК) на репарацию роговицы при экспериментальном ожоге.
Материалы и методы. Источником донорского материала служила ткань мозга эмбрионов 1–го триместра гестации (8–12 недель). Культуры исследовали на стерильность, острую токсичность и пирогенность. Перед трансплантацией суспензию клеток тщательно отмывали от культуральной среды, подсчитывали количество жизнеспособных клеток и суспензировали в минимальном количестве физиологического раствора.
Исследование проводилось на 75 кроликах (150 глаз) весом 2–2,5 кг, на которых была создана модель тяжелого щелочного ожога роговицы (аппликация роговицы диском хлопчатобумажной ткани диаметром 7 мм, пропитанным 10% раствором NаОН, время экспозиции 40 с). Животные были разделены на 2 группы – опытную и контрольную. В опытной группе сразу после нанесения ожога производилась субконъюнктивальная инъекция суспензии стволовых клеток с отработанной ранее концентрацией 300 тыс. клеток в 0,2 мл физиологического раствора. В контрольной группе вводили 0,2 мл физиологического раствора. С целью профилактики развития вторичной инфекции на всех глазах проводили местную противоинфекционную терапию в виде инстилляций антибиотиков (0,25% раствор левомицетина 3 раза в день).
Клинические методы исследования включали осмотр переднего отрезка глаз с помощью фокального и бокового освещения и биомикроскопию с флюоресцеиновой пробой и фоторегистрацией.
Оценку состояния глаз проводили на 7, 14, 22, 30 и 60–е сутки после трансплантации по следующим признакам: степени выраженности воспалительной реакции, диаметру дефекта эпителия, площади и глубине стромального дефекта роговицы, степени неоваскуляризации роговицы, интенсивности помутнения роговицы.
Степень выраженности воспалительной реакции оценивали по балльной системе Ченцовой Е.В. [4]. Площадь дефекта стромы роговицы определяли с помощью биомикроскопии. Дефект стромы по глубине изучали по схеме Венворта. Для оценки степени неоваскуляризации роговицы измеряли длину сосудов от лимба к центру роговицы [4]. Интенсивность помутнения роговицы оценивали по шкале Войно–Ясенецкого [1].
Результаты. На 7-е сутки после трансплантации в опытной группе глаз отмечалась менее выраженная, по сравнению с контролем, воспалительная реакция, а также не наблюдались перфорации, в то время как на 13,3% контрольных глаз имела место перфорация в 4 балла (рис. 1). В опыте проявлялась тенденция к уменьшению площади и глубины эрозии и изъязвления роговицы (рис. 2). На 82,7% опытных глаз диаметр эпителиального дефекта был в пределах 5 мм в среднем, т.е. на 2 мм меньше диаметра очага поражения. Диаметр эпителиального дефекта в контрольной группе был равен исходной величине – 7мм.
На 14-е сутки наблюдения воспалительная реакция в опытной группе глаз на 32% была меньше выражена, чем в контроле. В контрольной группе глубокие дефекты роговицы наблюдались в 86,7% случаев (рис. 3). Случаи перфорации роговицы участились на 5,5%, в то время как на большинстве опытных глаз (69,3%) имели место поверхностные дефекты стромы, площадь которых не превышала 1 балла. На 69,3% опытных глаз наблюдалась васкуляризация роговицы в 2 балла. Васкуляризация роговицы в 3 балла в опытной группе глаз встречалась в 3,2 раза реже, чем в контрольной группе (рис. 4). Отмечалось значительное уменьшение диаметра эпителиального дефекта в опыте (3 мм в среднем – 1 балл), в то время как в контроле он был близок к исходной величине (6 мм в среднем – 3 балла).
На 22-е сутки после трансплантации в опытной группе глаз в большинстве случаев наблюдалось закрытие стромального дефекта роговицы (58,7%), в то время как в контроле в 56% случаев сохранялись глубокие дефекты роговицы в 2 и 3 балла (рис. 5). Васкуляризация в 3 балла имела место в опыте в 4 раза реже по сравнению с контролем (рис. 6). Интенсивность помутнения по шкале Войно–Ясенецкого в опытной группе соответствовала 7 баллам, в контрольной – 10 баллам.
К 30-му дню после трансплантации в 89,3% случаев в опыте наблюдалось закрытие эпителиального дефекта, в то время как в контрольной группе глаз в 30,7% сохранялись поверхностные дефекты стромы (1 балл) (рис. 7). Степень васкуляризации и воспалительной реакции были также больше выражены в контроле (3 и 1 балла соответственно в контроле и 1 балл и 0 баллов в опытной группе глаз) (рис. 8). Интенсивность помутнения в опытной группе в среднем соответствовала 7 баллам прозрачности по шкале Войно–Ясенецкого, в то время как в контроле в большинстве случаев наблюдались помутнения в 10 баллов.
Спустя 60 суток после трансплантации в контрольной группе глаз в 12% случаев сохранялся поверхностный дефект стромы и в 17,3% – персистирующая эрозия (рис. 9), в то время как в опытной группе наблюдалось полное закрытие эпителиального дефекта роговицы на всех глазах (рис. 10). В опытной группе отмечалось формирование более нежного бельма роговицы по сравнению с контрольной (7 и 10 баллов соответственно). Степень васкуляризации и воспалительной реакции были более выражены в контроле (3 и 1 балла соответственно в контроле и 1 балл и 0 баллов в опыте).
Анализируя приведенные данные, можно сделать следующие выводы:
1. Разработана методика трансплантации СК при ожогах роговицы в эксперименте.
2. Эффект трансплантации СК проявляется в ускорении процессов восстановления дефектов переднего эпителия и стромы роговицы (рис. 11).
3. Трансплантация СК на ожоговую поверхность роговицы способствует формированию помутнения роговицы меньшей интенсивности и площади.
4. Трансплантация СК при экспериментальных ожогах роговицы снижает степень васкуляризации роговицы.
5. Трансплантация СК при ожогах роговицы способствует сокращению продуктивной стадии воспаления тканей глаза.
6. На основании полученных клинических данных доказана эффективность трансплантации СК в ранние сроки после ожога.
Таким образом, результаты проведенного экспериментального исследования свидетельствуют о положительном влиянии трансплантации стволовых клеток на течение ожоговой болезни и подтверждают целесообразность дальнейшего изучения данного вопроса в офтальмологии.

Литература
1. Войно–Ясенецкий В.В. Разрастание и изменчивость тканей глаза при его заболеваниях и травмах. – Киев, 1979. – 184с.
2. Гундорова Р.А., Бордюгова Г.Г., Южаков А.М. Лечение и профилактика осложнений ожогов органа зрения: Метод. рекоменд. – М., 1982. – 11с.
3. Либман Е.С., Кремкова Е.В., Иофан К.Л. Эпидемиология ожогов глаз и инвалидности вследствие ожоговой болезни // Новое в лечении ожогов глаз: Тез. докл. симпоз. с участием иностранных специалистов. – М., 1989. – С.76–77.
4. Ченцова Е.В. Система патогенетически обоснованного лечения ожоговой травмы глаз. Дис. Е д–ра мед. наук. М. – 1996. – 304 с.
5. Pfister R.K. Chemical corneal burns //Int. Ophthalmol. Clin. – 1984. – V.24, № 2. – P.157–168.
6. Stark W. Transplantation antigens and keratoplasty //Microsurgery of anterior and posterior segments of the eye. – 1981.– P.33–40.